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Make sure tube is at a shallow angle like this:  Sporulate at 25( for 3-10 days (check them under the microscope every couple of days and dissect when you have plenty of tetrads) For tetrad dissection: Dry some YPD plates for a few days on the bench Mix 3µl sporulated culture, 27µl Buffer A (1.2M sorbitol, 50mM EDTA), 1µl 17U/µl high grade lyticase Incubate 30min at RT, then streak 3µl over the appropriate area of the YPD plate Wait for the spots to dry then dissect immediately Media: GNA Presporulation Plates Final Concentrationsrecipe for 2 platesrecipe for 10 plates5% D-glucose 5 gm25 gm3% nutrient broth (powder or microgranulated)3 gm15 gm1% yeast extract 1 gm5 gm2% agar2 gm10 gmwater to the final volume100 ml500 mlAutoclave for 15 minutes. Plates should always be freshly made and last only for 1-2 weeks at 4°C for optimum sporulation. Liquid Sporulation Medium Final ConcentrationsStock solutionsrecipe for 20 mls1% Potassium Acetate10% Potassium Acetate (20g/200ml)2 mls0.005% Zinc Acetate0.5% Zinc acetate (1g/200ml)0.2 mlsInclude amino acids/nucleotides from 100x / 10x stocks to complement any homozygous auxotrophies in the diploid. Not doing this can reduce spore viability substantially. Lyticase stock: 17U/(l lyticase (Sigma >2000 U/mg L2524) 10mM KPi pH7 50% glycerol Store at -20( Note calculate lyticase stock using U/mg solid      FILENAME BY4741 sporulation.doc v1.4 Houseley lab  PAGE 2 Q�ØÙÚöü       - < K N O X p q s } † ‡   È è A B D E S T Y ] b c o „ Å Æ Ç È ß à  3 8 : ü ÿ  öêæâÞÚâÖÚÖÞÒâÒâÒâÒâÒâÒâÒâÒËÒÞâÚâÇâǿǻڴÚÇÞ°ÇâÇÞÇÞ¨æÖ¤Ö¤ÖŸ—hkJhkJ5� h 1m5�h&#«hÛºhÛº6�hÒ j°ðh!Šh6 +jh6 +UhÞ.8 j°ðhÞjihÞjih 1mh!Šh‘2žh�&rhÛºhÊ4'h³cH5�CJ(aJ(h!b€5�CJ(aJ(;ÙÚr s @ A C D Æ Ç È ß à   v w È É ü ý þ   ÷õðõõõõõõõõõõõõëëëëëëëæææægdkJgd 1mgd�&r$a$gd³cH " 7 K ` a o t z úôôô_ôVV $$Ifa$•kd­$$If–ÖÖFÄÿFyã"€2 €ð€#Ö0ÿÿÿÿÿÿö×6ööÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿ3Ö4ÖaöbÖ ytL=/$IfgdkJ ` a z { � ¨ ´ µ Ñ Ò å æ   ‹ ¤ Ê × Ü Ý LNTU\‹þÿhimœ�žŸ¡¢¤¥§¨ª«µ¶ÌÍÏÒÓàãüôüôüðüôüôüôüôüéüåüôüåüôüåüôáåáüÝÖÝÏÝÊÝû·»·»·»·¯«¯¢¯žá«š«h`|hºV±h!ŠmHnHuh!Šjh!ŠUhb©jhb©U h!ŠhkJ h—1Å5� j°ðh—1Å jmðh—1Åh—1ÅhÞ.8hþÓ hkJ5�\�hL=/hkJCJaJhkJ:z { © ® ´ jaXX $$Ifa$ $Ifgd 1m•kdc$$If–ÖÖFÄÿFyã"€2 €ð€#Ö0ÿÿÿÿÿÿö×6ööÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿÖ ÿÿÿ3Ö4ÖaöbÖ ytL=/´ µ Ç Ì Ñ 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